게시: 2022-03-16 원산지 : 강화 된
유기체의 게놈은 DNA 분자 내에 저장되지만이 유전 정보를 분석하려면 다량의 DNA가 필요합니다. 1985 년 Kary Mullis는 짧은 기간 동안 소량의 DNA를 대규모로 복제하는 효율적인 방법을 발명했습니다. 가열함으로써, DNA 분자의 2 개의 가닥이 분리되고, 첨가 된 DNA 빌딩 블록은 각각의 가닥에 결합한다. 효소 DNA 중합 효소의 도움으로 새로운 DNA 가닥이 형성되고 그 공정이 반복 될 수있다. PCR은 의학 연구 및 법의학 모두에서 매우 중요합니다.
PCR의 전체 이름은 중합 효소 연쇄 반응입니다. 매우 간단하지만 효율적인 방법으로 DNA를 복제 할 수있는 매우 강력한 기술입니다. 그것은 유기체 외부의 특별한 DNA 복제로 간주 될 수 있습니다. PCR의 가장 큰 특징은 DNA의 미량 양을 크게 증가시킬 수 있습니다.
DNA 복제는 많은 연구의 기초입니다. 예를 들어 RNA를 시퀀싱 할 때 RNA는 먼저 DNA로 변환되어 많은 수로 복제되어야합니다. 사람의 게놈을 시퀀싱 할 때, 우리는 세포 또는 단일 분자를 시퀀싱 할 수 없습니다. 시퀀싱의 기초는 DNA 분자의 많은 수의 동일한 사본을 필요로하므로 DNA 복제는 생물 연구의 기본 도구입니다. 그렇다면 어떻게 많은 사본을 얻을 수 있습니까? PCR은 DNA의 대량 복제를위한 탁월한 방법이되기 위해 DNA의 여러 가지 특성을 이용하여 복사기와 같습니다.
1. 초기 단계 : 이것은 핫 스타트 PCR에 필요한 경우, 반응 혼합물을 94-98 °로 가열하여 DNA 중합 효소를 활성화시킨다. 이 단계의 타이밍은 선택된 DNA 중합 효소에 따라 다릅니다.
2. 변성 단계 : DNA 자체는 이중 가닥 구조이며, DNA 증폭은 프라이머와 단일 가닥 DNA 템플릿의 조합을 필요로합니다. 이 단계에서, 반응 혼합물을 20-30 초 동안 94-98 ℃로 가열하여 이중 가닥 사이의 수소 결합을 분해하고 단일 가닥 DNA를 방출한다. 이것은 PCR 사이클의 첫 번째 단계입니다.
3. 어닐링 단계 : 변성 후, DNA 템플릿은 반응 혼합물에 단일 가닥으로 존재한다. 반응 시스템의 프라이머가 DNA 주형에 상보이기 때문에 반응 온도가 50-65 °로 떨어지면, 프라이머는 수소 결합을 상보적인 서열과 형성한다. 어닐링 온도는 주로 프라이머의 TM 값보다 3-5 ° 낮은 프라이머의 TM 값에 의존합니다. 이 단계는 일반적으로 20-40 초 동안 지속되며 중합 효소는 Primer-Template Duplex에 결합하여 DNA 합성을 시작합니다.
4. 연장 단계 :이 단계에서 DNA 중합 효소는 DNA 합성을 시작 하므로이 단계의 온도는 DNA 중합 효소의 최적 온도입니다. 보통 우리는 72도를 선택하지만 일부 DNA 중합 효소의 최적 온도는 68도입니다. 이 단계는 Vivo에서 DNA 복제와 매우 유사합니다. DNA Polymerase는 기본 보완의 법칙에 따라 프라이머의 3 '끝에 DNTPS를 추가하고, 마지막으로 새로운 DNA 이중 가닥 단편이 얻어진다. 연장 시간은 DNA 조각의 길이와 DNA 중합 효소의 합성 능력의 길이에 의존합니다. 일반적으로 DNA 중합 효소는 60 초마다 1KB DNA를 합성 할 수 있습니다.
5. 2 ~ 4 단계를 사이클이라고합니다. 각 사이클 후의 DNA의 양은 이전의 것의 두 배입니다. 전형적으로, PCR 반응은 30-35 사이클 동안 수행된다. PCR 사이클의 처음 몇 라운드 동안 PCR 생성물의 양은 기하 급수적으로 증가했으나 반응의 후반 단계에서 DNTPS 및 프라이머의 양의 감소 및 DNA 중합 효소의 불 활성화를 감소시켜 반응 속도가 점차적으로 감소되었으므로 PCR 반응의 수율도 감소했다. 제한된.
6. 최종 확장 단계 : 30-35 사이클 후, 우리는 일반적으로 68-74도에서 5-10 분 동안 연장되며, 이는 반응 시스템에서 나머지 단일 가닥 DNA가 반응을 완료하게합니다.
7. 유지 시간 : 보통 우리는 반응 후 PCR 제품의 보관 온도로 4-10 °를 설정합니다.